Hiv-testing utenfor helsevesenet

Fosfoflow innen KLL

Sigrid S. Skånland, | Nov 2018 | Onkologi /hematologi |

Sigrid S. Skånland,
forsker, ph.d.,
Institutt for kreftforskning,
Oslo universitetssykehus,
Institutt for klinisk medisin,
Universitetet i Oslo

Kronisk lymfatisk leukemi (KLL) kjennetegnes av stor biologisk og klinisk heterogenitet. Mens omkring 30 % av pasientene har en indolent sykdom og aldri blir behandlingstrengende, vil omkring 10 % av pasientene ha en aggressiv sykdom og dø i løpet av 1-3 år etter diagnose.1 

Hvordan kan vi forstå de underliggende mekanismene for denne variasjonen og identifisere biologiske markører (biomarkører) som kan veilede valg av effektiv terapi for den enkelte pasient? Store genomiske analyser har identifisert mutasjoner i KLL, men ingen av mutasjonene er observert i mer enn 20 % av pasientene, noe som understøtter at KLL er en heterogen sykdom. Videre finnes det få FDA-godkjente medikamenter som er rettet mot kreft-assosierte mutasjoner.

I KLL er del(17p)/TP53-mutasjon eneste (negative) responspredikator som for øyeblikket blir brukt i klinisk praksis. Pasienter med denne mutasjonen responderer dårlig på immunokjemoterapi. Mutasjonsanalyser har derfor begrenset anvendelse når det kommer til valg av behandling. Det er imidlertid grunn til å tro at karakterisering av signalmolekyler kan bidra til økt forståelse av KLL, og at disse kan fungere som markører for valg av behandling.

Anerkjennelsen av at signalering nedstrøms for B-cellereseptoren spiller en betydelig rolle i utviklingen av KLL førte til at nye legemidler som er rettet mot de tilhørende intracellulære signalveiene, kom på markedet. Disse inkluderer ibrutinib,2 en Btk-hemmer og idelalisib,3 hemmer av PI3-kinase. De nye legemidlene har hatt stor innvirkning på hvordan KLL behandles i dag og tydeliggjør den kliniske betydningen av å kartlegge signalveier i KLL.

Her introduseres fosfoflow som metode for å analysere signalveier i KLL, noen av våre resultater samt mulige fremtidige applikasjoner.

Anvendelig metode – store data
Fosfoflow er basert på farging av celler med fosfo-spesifikke antistoffer etterfulgt av flowcytometrianalyse4 (figur 1). Cellene som skal studeres, blir først fiksert for å bevare alle fosfoproteiner, deretter permeabilisert for å tillate at antistoff kan trenge inn i cellen og binde til intracellulære fosfoproteiner. Før farging med antistoff merkes de ulike celleprøvene man ønsker å analysere i samme forsøk med en unik signatur av fluorescerende farger.

Ved å benytte tre ulike fluorescerende farger i 3-4 fortynninger kan nesten 40 KLL-prøver få sin unike signatur som kan blandes sammen til én populasjon. Denne populasjonen blir så farget med fosfoantistoff og analysert på flowcytometeret som én prøve. De individuelle KLL-prøvene vil bli identifisert ved hjelp av sin spesifikke fargesignatur i dataanalysen. At de ulike prøvene i forsøket kan farges samtidig gjør at mengden antistoff som er nødvendig, og dermed kostnadene til førsøket, reduseres. Viktigere er det at variasjon mellom prøvene reduseres ved at kontroller og testprøver farges samtidig. Det fører også til at forsøket kan analyseres på kortere tid.

Fordeler med fosfoflow inkluderer at et stort antall prøver og proteiner kan analyseres på kort tid, samt at forsøkene produserer data på enkeltcellenivå og ikke gir et gjennomsnitt av hele cellepopulasjonen slik tilfellet er ved bruk av for eksempel Western blot. Fosfoflow er derfor en svært anvendelig metode som kan benyttes til å kartlegge hvilke signalveier som er aktivert i KLL, om det er ulikheter mellom pasienter, og hvilken effekt terapi har på fosforylering av signalmolekyler, for å nevne noe.

Fosfoflow kan indikere målrettet behandling
Vi og andre5-9 har ved hjelp av fosfoflow kartlagt signalmønstre i tumorceller fra KLL-pasienter relativt til normale B-celler. Ved å studere basalnivåene til 20 ulike fosfoproteiner i 22 KLL-pasienter og 25 friske donorer var vi de første til å vise at STAT3 (pY705) er oppregulert i en gruppe pasienter.5 Konstitutiv aktivering av STAT3 har tidligere blitt påvist i andre kreftformer og har vært relatert til resistens mot celledød.10 Når KLL-celler ble behandlet med to ulike STAT3-hemmere (WP1066 og niclosamide), fant vi at disse medikamentene reduserte STAT3 (pY705)-nivået og drepte tumorcellene. Av interesse er STAT3-modifiserende medikamenter under utprøving på KLL (pyrimethamine, doxycycline, flavopiridol; ClinicalTrials.gov).

I den samme studien viste vi at AKT (pS473), som er nedstrøms for PI3-kinase, er oppregulert i IgHV umutert KLL relativt til både IgHV mutert KLL og normale B-celler. Behandling av KLL-celler med PI3-kinase-hemmeren idelalisib reduserte svært effektivt dette signalet.5 Vi har tidligere vist, ved hjelp av fosfoflow, at kinasen SYK er aktivert i KLL-celler, og at SYK-hemmere selektivt dreper KLL-celler, men ikke normale B-celler.7,11 Resultater fra signalanalyser kan dermed indikere målrettet behandling.

Kan fosfoflow identifisere nye biomarkører?
På sikt er målet å etablere en prosedyre for å identifisere biomarkører som kan forutsi respons på terapi i den enkelte KLL-pasient. Arbeidshypotesen er at signalmolekyler kan fungere som slike markører. For å teste dette vil en naturlig fremgangsmåte være å behandle KLL-prøver med et stort bibliotek av klinisk relevante medikamenter og parallelt studere hvor effektivt medikamentene dreper tumorcellene, og hvilken effekt de har på ulike signalmolekyler (figur 1). De to datasettene kan så sammenlignes for å kartlegge korrelasjoner mellom celledød og signalrespons og således identifisere potensielle biomarkører. Slike studier kan gi svar på om fosfoflow kan benyttes til å definere nye biomarkører.

KONKLUSJON

KLL er en svært heterogen sykdom, og cellesignalering spiller en sentral rolle i både sykdomsforløp og utvikling av resistens mot behandling. Basal forståelse av signalering i KLL har muliggjort fremstilling av nye, effektive behandlingsformer. Jeg foreslår at kartlegging av signalering i KLL også kan veilede valg av presisjonsmedisin, og at fosfoflow kan benyttes til dette formålet.

Referanser

1. Rozovski U, Hazan-Halevy I, Keating MJ, Estrov Z. Personalized medicine in CLL: current status and future perspectives. Cancer Lett 2014;352:4-14. 2. Byrd JC, Furman RR, Coutre SE, Flinn IW, Burger JA, Blum KA, Grant B, Sharman JP, Coleman M, Wierda WG, Jones JA, Zhao W, Heerema NA, Johnson AJ, Sukbuntherng J, Chang BY, Clow F, Hedrick E, Buggy JJ, James DF, O’Brien S. Targeting BTK with ibrutinib in relapsed chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med 2013;369:32-42. 3. Furman RR, Sharman JP, Coutre SE, Cheson BD, Pagel JM, Hillmen P, Barrientos JC, Zelenetz AD, Kipps TJ, Flinn I, Ghia P, Eradat H, Ervin T, Lamanna N, Coiffier B, Pettitt AR, Ma S, Stilgenbauer S, Cramer P, Aiello M, Johnson DM, Miller LL, Li D, Jahn TM, Dansey RD, Hallek M, O’Brien SM. Idelalisib and rituximab in relapsed chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med 2014;370:997-1007. 4. Skånland SS. Phospho Flow Cytometry with Fluorescent Cell Barcoding for Single Cell Signaling Analysis and Biomarker Discovery. J Vis Exp 2018 140, e58386. 5. Myhrvold IK, Cremaschi A, Hermansen JU, Tjønnfjord GE, Munthe LA, Taskén K, Skånland SS. Single cell profiling of phospho-protein levels in chronic lymphocytic leukemia. Oncotarget 2018;9:9273-9284. 6. Blix ES, Irish JM, Husebekk A, Delabie J, Forfang L, Tierens AM, Myklebust JH, Kolstad A. Phospho-specific flow cytometry identifies aberrant signaling in indolent B-cell lymphoma. BMC Cancer 2012;12:478. 7. Parente-Ribes A, Skånland SS, Burgler S, Os A, Wang D, Bogen B, Tjønnfjord GE, Taskén K, Munthe LA. Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce CD40L-induced proliferation of chronic lymphocytic leukemia cells but not normal B cells. Haematologica 2016;101:59-62. 8. Myklebust JH, Brody J, Kohrt HE, Kolstad A, Czerwinski DK, Wälchli S, Green MR, Troen G, Liestol K, Beiske K, Houot R, Delabie J, Alizadeh AA, Irish JM, Levy R. Distinct patterns of B-cell receptor signaling in non-Hodgkin lymphomas identified by single-cell profiling. Blood 2017;129:759-770. 9. Palomba ML, Piersanti K, Ziegler CG, Decker H, Cotari JW, Bantilan K, Rijo I, Gardner JR, Heaney M, Bemis D, Balderas R, Malek SN, Seymour E, Zelenetz AD, van den Brink MR, Altan-Bonnet G. Multidimensional single-cell analysis of BCR signaling reveals proximal activation defect as a hallmark of chronic lymphocytic leukemia B cells. PLoS One 2014;9:e79987. 10. Siveen KS, Sikka S, Surana R, Dai X, Zhang J, Kumar AP, Tan BK, Sethi G, Bishayee A. Targeting the STAT3 signaling pathway in cancer: role of synthetic and natural inhibitors. Biochim Biophys Acta 2014;1845:136-154. 11. Skånland SS. Bruk av SYK hemmere ved KLL. BestPractice Onkologi / Hematologi 2016;24:22-23.